１．pH測定の原理と多様な電極

pHは水溶液の酸性、アルカリ性の度合いを示す指標であり、水素イオン活量の対数で定義される。活量とは、周りのイオンや溶媒分子との相互作用を反映した量で、溶液が低濃度の場合には実質的には活量と濃度（mol/L）は等しいと考えることができる。pH7を中性、これよりpH値が小さいときは酸性、大きいときはアルカリ性と呼ぶ。現在はガラス電極を用いた電位差測定法（以下、ガラス電極法）が、JISでは標準法として定められている。ガラス電極法では、あらかじめpHが割り当てられた標準液を用いた校正が必要となり、JIS（Z8802）では6種類のpH標準液が定められている。ガラス電極法はpHに応答する作用電極と、溶液の濃度や組成に依らず一定の電位を示す参照電極との間に発生する電位差を測定し、pHに変換する（図1）。作用電極の主流はガラス電極であり、その応答機構はガラス膜表面相と試料溶液間での水素イオンの分配平衡に基づいている。一方、参照電極は、液絡部と呼ばれる試料溶液との接合部から、高濃度のKCl溶液を試料溶液側に絶えず流出させることで、試料溶液と参照電極の内部液の間の液間電位差を一定に保っている。近年は作用電極と参照電極が組み合わされた複合型電極が広く使用されている（図2）。

またアプリケーションの拡大に伴い、測定用途に応じた様々なタイプのガラス電極が開発されてきたが、その発展形としては大きく性能面と形状面に二分される。前者の例としては低電気伝導率サンプル向けやガラスを溶かす性質のあるフッ酸に対して耐久性を向上させた電極などが、後者としては突き刺し測定が可能なニードル形状や、平面測定を可能とするフラット形状となっている電極が挙げられる。ガラス電極以外の作用電極として他にもアンチモン電極や半導体技術を利用したISFET電極があり、それぞれ特長を生かせる分野にて使用されている。一方、参照電極も内部液を流出させる液絡機構や内部極構造においてその種類が多岐に渡り、作用電極との組み合わせ次第で非常に多様な電極構成が可能となる。しかしながら従来のpH電極は、参照電極において内部液の容量を確保するためにある程度の体積が必要なことから、電極の小型化およびコストダウンに課題を残していた。

２．課題解決に向けた近年のセンサ技術

小型で安価なpH電極の需要が高まる中、近年ではさらに応答物質材料は多様化し、従来のガラス電極やISFET電極、アンチモン電極以外にも、種々の金属あるいは金属酸化物系電極^1)-5)、ポリアニリンを応答膜とした導電性高分子系電極⁶⁾などが報告されている。また特にここ数年、アプリケーションとしてウェアラブルデバイスへの搭載を見据えたフレキシブルセンサ形態での評価も盛んに行われている。導電性高分子は応答膜そのものが柔軟性を有していること、金属酸化物を応答材料とする電極は、導電性クロスの上に酸化物ナノ粒子を担持する方法⁵⁾や、酸化物ナノ粒子を導電性薄膜上にインクジェット印刷する⁷⁾方法が可能であることから、従来のガラス電極と比較し電極形状の自由度も向上している。センサの薄膜化・小型化という点においても、これらの新技術は作用電極部に内部液を必要とせず、その点で従来のガラス電極よりも小型化に適した構造となっている。
ガラス電極の場合には、応答膜の加工に繊細な感覚が必要なことから、職人の熟練した技術に頼って生産される場面が多く、製造工程という観点でも大量生産にも限界があった。上記に紹介した新技術ではセンサ部を機械的に生産できる可能性も有しており、大量生産による安価なpHセンサとしても期待できるものである。
ISFET電極は従来用いられていたセンサでもあるが、半導体プロセスを経て製造されており、微小なセンサを高密度に集積可能なことから、その特長を生かしてDNAシーケンサにも利用されている⁸⁾。DNAシーケンサでは1万個以上ISFETアレイが並列されており、DNAの伸長反応において発生するpH変化をそれらが同時並行で検出することで、DNA配列を高速で解読することができる。こちらは半導体プロセスによってセンサの大量生産が可能であることをうまく活用したアプリケーションとなっている。

一方、参照電極にも様々な技術が取り入れられ開発が進められている。例えば、イオン液体を液絡に用いた電極⁹⁾では、内部液である塩化カリウム水溶液をほとんど流出させずに測定を行うことが可能となっている。これにより、塩化カリウムと反応を起こすサンプルや、少量の塩化カリウムのコンタミネーションにも敏感な低電気伝導率のサンプルの測定を安定して行うことができる。またイオン液体に樹脂を混合して固体化させることで、完全に内部液が不要な技術も研究されている¹⁰⁾。この他にもフィルム基材上に薄膜状完全固体の銀/塩化銀電極を形成し、微小な参照電極とする手法もある^11,12)。内部液が不要な参照電極は、現状、従来の内部液を有するタイプの参照電極と比較すると安定性などで劣っている面もあるが、今後さらなる発展が期待できるものとなっている。またpHに応答しないFETや金属電極を参照電極²⁾とする技術もあり、pH電極の小型化にとって重要な課題である参照電極の完全固体化に向けたアプローチも複数展開されている。これら参照電極の固体化・小型化技術を前述した作用電極の技術と組み合わせることで、さらに多種多様な電極が実現できるようになり、要求精度や使用形態に合わせたpH電極の選択の幅がより広くなるだろう。
また電気化学的手法以外にも、蛍光色素を利用しその発光強度や蛍光寿命をイメージングによってpHを解析する手法¹³⁾もあり、電極での測定が困難な細胞や臓器といった生体反応の分析に主に利用されている。

次回に続く－

【著者紹介】
辻　皓平（つじ　こうへい）
株式会社堀場アドバンスドテクノ　開発本部

■略歴
2016年　株式会社堀場製作所へ入社。
                   pH、イオンセンサの開発業務に従事。
2017年　株式会社堀場アドバンスドテクノへ転籍。
                   引き続きセンサ開発業務に従事し、現在に至る。

＜はじめに＞

我々科学者にとってpHというパラメータは馴染みが深い。それはpHが様々な化学種の活性を制御する物理量だからである。したがって、多様な化学種が混在している生体内部では、pHは特に重要である。生体内のpHは微小空間ごとに厳密に制御されており、これが高次な生命現象の発現に深く関与している。そしてこの生体内のpH異常は、脳卒中や心不全、自己免疫疾患など様々な生命現象、疾患に関連している。例えば、がん細胞においては細胞表面の数ナノメートルの微小空間でpHが酸性に傾いており、このことががん細胞の転移、組織浸潤に影響を与えているとされている。したがって、微小空間のpHをモニターすることが可能になれば、生命現象の基礎的な理解が深まるだけでなく、創薬をはじめとする医療分野にも貢献できると期待される。このような微小空間のpH測定を実現するためには、一つの細胞(約20µm)よりも小さなpHセンサが必要である。しかしながら、我々が通常のpH測定で用いるリトマス試験紙やpHメーターはこれよりも遥かにサイズが大きいため、このような微小空間のpH測定に使用することはできない。

１.＜センサとしてのダイヤモンド＞

我々のグループでは、微小なpHセンサを開発するための材料として蛍光ナノダイヤモンド(Fluorescent Nanodiamond,FND)に注目した。FNDはナノメートルサイズのダイヤモンド粒子であり、微小空間における温度や磁場を測定可能な超高感度センサとして近年注目を集めている。このセンサの動作原理の根幹を担っているのが、FNDの内部に存在する窒素-空孔中心(Nitrogen-Vacancy Center,NVC)である(図1a)。NVCはダイヤモンド中の炭素原子が、隣り合った窒素と空孔に置き換わった格子欠陥である。このNVCに電子が一つトラップされることで、以下に示す3つの特異な量力学的性質を示すようになる。
1つ目は褪色しない蛍光を発する点である。一般的な蛍光色素においては、励起光による化学構造の変化によって蛍光強度が減少してしまう。このため、あらかじめ一定面積以上の蛍光色素の集団を用いて測定を行う必要があり、それに伴い空間分解能が制限される。一方、安定なダイヤモンド中に形成されたNVCは、光学安定性が非常に高いため褪色を示さず、たった一つのNVCのみで測定を行うことも可能である。これによって空間分解能は数ナノメートルに達するため、NVCは「微小空間」の物理量測定に適している。

2つ目は、NVCのスピン量子状態が温度や磁場、電場といった様々な物理量と厳密に共役している点である。すなわち、NVCのスピン量子状態を読み取ることで、スピンに影響与える「様々な物理量」を定量することが可能である。3つ目はNVCの量子状態が可視光で読み取ることができる点である。一般的な磁気共鳴法によるスピン量子状態の読み取りにおいては、マイクロ波帯のごく低いエネルギーの検出が必要となる。このため、スピンをセンサとして活用する計測手法は一般に低感度であった。一方、可視光(波長:600nm、エネルギー:2eV)はマイクロ波(波長:0.1m、エネルギー:1×10^-5eV)と比較してエネルギーが桁違いに高く、「超高感度」の物理量測定を可能にする。以上の3つの性質から、NVCのスピン量子状態を可視光で読み取ることにより、「微小空間」における「様々な物理量」を「超高感度」で測定することが可能である。

以上のようなNVCの量子力学的性質を用いた測定手法は量子センシングと呼ばれている。一例として、我々がNVCを用いて行った温度に関する量子センシングの結果を示す(図1b)。温度(T)依存的にNVCの共鳴周波数(f)のシフトが観察され、f=-0.065T+2889.23と定式化された。また現在までに、30秒間の測定時間で1.8mKという高い精度で温度測定が可能であることが示されている¹⁾。また、磁場や電場、圧力といった物理量に関しても、量子センシングによって高い感度で測定可能であることが示されている。しかしながら、これまでの研究で測定対象とされている物理量の多くは、ダイヤモンド結晶内のNVCのスピン量子状態に直接影響を与える温度や磁場、電場といった物理量に限られてきた。特にpHは、NVCのスピン量子状態に直接影響を与えない物理量であるため、従来の方法ではFNDを用いてpHを測定することは困難であった(図1c)。

２.＜pHセンサとしてのFND＞

我々のグループでは、特殊な機能化処理によって、FNDを微小なpHセンサとして活用する方法を考案した(図2)。具体的な機能化処理としては、pH依存的に電荷状態が変化する官能基であるカルボキシ基をFND表面にコーティングした。カルボキシ基はpH4から5以下の酸性条件下では中性状態(-COOH)であるが、それ以上のpH条件下で負電荷状態(-COO-)に変化する。このカルボキシ基の電荷状態の変化がNVCのスピン量子状態に干渉することで、縦緩和時間(T₁)と呼ばれる値が変化する。この場合のT₁とは、レーザー照射によって非平衡化されたNVCの量子状態が、平衡状態に戻るまでの時間である。

実際に、大気中での熱酸化、および硫酸と硝酸が共存した状態での熱処理によってカルボキシ基をFND(約100nm)に修飾した(図3a)。このカルボキシ化したFNDを用いて様々なpH条件下でT₁を測定したところ、カルボキシ基の電荷状態が変化するpH4から5付近でT₁が大きく変化した(図3a)。すなわち、pH依存的に電荷状態が変化する官能基をFNDの表面に修飾する方法によって、pH変化をT₁の変化として検出することが可能であることが示された。また、一般的なpHセンシングにおいてはセンサの可逆性がしばしば問題となるが、今回我々が開発したpHセンサの動作原理は、官能基の可逆的な電荷状態の変化に基づいているため、pH変化を可逆的にセンシングすることが可能であると考えられる(図3c)。実際、pHを9と3で交互に変化させた際に、カルボキシ化したFNDのT₁がpHに対応して交互に変化したことから、我々の開発したpHセンサが可逆的に動作することが示された。

次回に続く－

【著者紹介】
藤咲　貴大（ふじさく　たかひろ）
京都大学　大学院工学研究科　分子工学専攻

■略歴
2016年京都大学工学部工業科学科卒業。2018年京都大学大学院工学研究科分子工学専攻修士課程卒業。2018年から現在まで同博士課程に在籍。
これまで、NVCを用いた新規pHセンシング手法の開発に取り組んできた。今後は、pH以外の物理量の測定方法の開発や生体への応用など、NVCを用いた量子センシング技術の汎用化に挑戦していきたい。

半導体微細加工によるMEMS(Micro Electro Mechanical Systems)技術を用いると、高度なセンサなどが安価に製造でき、これらはIoTのキーデバイスとなっている。ここでは装着に適した構造の半導体イオンセンサについて述べる。

1.半導体イオンセンサ(装着に適した構造)

47年前の大学院生の時(1971年)に研究した、ISFET(Ion Sensitive Field Effect Transistor)と呼ばれる半導体イオンセンサを紹介する。電解液中の特定のイオンの濃度を計測するには、図1左に示すイオン選択性電極が使われている。水素イオン濃度であるpHを測るガラス電極はその代表例であるが、イオン感応層であるガラスと液の界面電位がpHで変化し、その電位はガラス膜を通して測定されるため、小型化すると高抵抗になる問題があった。ISFETの場合は図1右のように絶縁ゲートFETのゲート絶縁膜上にあるイオン感応層表面で生じる電位を、FETで電流に変換するため、小形化に適している。水素イオンの場合にはイオン感応層表面のSi-OH基が液中の水素イオン濃度に対応して、酸性の場合には　Si-OH₂⁺にアルカリ性の場合にはSi-O^–に、それぞれ電荷を持ち界面電位を生じる。どのイオンに選択的に応答するかはイオン感応層表面組成により以下のような機構で変わり、表面にSi-Al-O^–基を持つアルミノシリケートをイオン感応層に用いるとNa⁺イオンに応答する。Si-O^–基の場合は電界が強いため、H+イオンを水和した状態から分離させて結合しpHセンサとして働く。これに対しSi-Al-O^–基の場合にはSi-O^–基よりも負電荷が分散し電界が弱いためにH⁺イオンは水和状態にあるが、水和エネルギの弱いNa⁺イオンはSi-Al-O^–基と結合することができてpNaセンサとなる。これを利用しpHとpNaを測れるマルチイオンセンサ用ISFETも製作されている¹⁾。